腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体是神经疾病基因治疗研究中常用的载体。在设计新型重组AAV衣壳、改善组织向性和提高CNS转导效率的临床前研究中，已经取得了相当大的进展。随着越来越多的基因治疗载体的出现，迫切需要开发准确、快速的定量技术，用于测量复杂组织中的病毒转导。

AAV-PHP病毒衣壳工程是中枢神经系统研究和大脑基因表达调节的一个重要进展。它们通过血脑屏障并在静脉系统传递后转导脑细胞，这一特性依赖于AAV-PHP衣壳受体Ly6a的基因型。重要的是确定特定病毒制剂的转导效率，以及不同脑细胞的相对趋向性;然而，人工估计腺相关病毒转导效率可能有偏差和耗时。因此，相关研究者使用Opera Phenix高含量筛选系统，配备了Harmony处理和分析软件，以减少偏差，并开发了一种自动方法来确定鼠脑的转导效率。

他们使用R Studio和“gatepoints”将从冠状脑部分捕获的数据分割成皮质、纹状体和海马体。C57BL/6J和CBA/Ca小鼠注射AAV-PHP。含有一个带有核定位信号的绿色荧光蛋白报告物的B病毒。以600 μm间隔的冠状切片对全脑进行Hoechst染色，结合免疫荧光NeuN和绿色荧光蛋白分别鉴定所有的细胞核、神经元和转导细胞。

自动数据分析应用于估计整个大脑以及皮层、纹状体和海马的神经元百分比和转导效率。每只小鼠的冠状切片数据具有高度可比性。Hoechst信号用于识别所有的细胞核，在本研究中，切片分别用NeuN和GFP免疫染色来识别神经元和转导细胞。C57BL/6J和CBA/Ca大脑中神经元的比例约为40%，皮质高于纹状体和海马。系统注入AAV-PHP。

对于C57BL/6J小鼠，B在整个大脑中产生类似的转导率。大约有10-15%的细胞被转导，神经元转导效率从5%到15%不等，估计在大脑区域是相似的，与通过脑内注射获得的更局部的转导效率形成对比。

研究者在此过程中确认了AAV-PHP的交付。B型病毒从脉管系统到大脑导致广泛的转导。本快速方法允许与更费时的大脑区域之间的转导率产生数据进行比较。

这一自动分析树提供了一个无价的工具，以快速评估新工程AAV衣壳的取向。可以选择抗体库来研究大脑或不同组织中指定细胞的转导效率，可以修改组织切片取样的频率，以确定在分段ROI中转导效率的任何变化。应用此分析，通过添加小标签，确认病毒制剂在临床前基因治疗实验中的趋向性和转导效率，将提供重要的质量控制数据，以支持疗效研究。

在更广泛的背景下，本研究开发的方法将有助于减少偏差，并自动定量任何感兴趣的参数，可以捕获作为荧光信号。

医博士编译自：Smith EJ & Farshim PP. Use of high-content imaging to quantify transduction of AAV-PHP viruses in the brain following systemic delivery. Brain Commun. 2021; 3(2):fcab105. doi:10.1093/braincomms/fcab105.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34131644/